PREPARATY TRWAŁE

No, może nie tak całkiem TRWAŁE, ale takie, które mi trochę (z miesiąc, może kilka mcy) poleżą.

Po zrobieniu preparatu z H2O (woda) - strasznie szybko one wysychają. Zwłaszcza, że podczas mikroskopowania sam mikroskop jest gorący od żarówki, która emituje dużo ciepła i prepatat wysycha na oczach. Niestety to samo się tyczy Kongo.
Gdy daję KOH (Melzer) to Lugola jest bardziej.... "tłusta" i aż tak szybko nie wysycha.

Jak zrobić preparat, do którego będę mógł wrócić za kilka mcy? ??

Ten tamat juz był chyba poruszany, ale nie mogę go znaleść. Wymyśliłem sobie tak, i proszę kogoś doświadczonego o korektę moich planów.

1. Szkiełko podtawowe z miejscem na opis (np. Menzel - Glaser).
2. Szkiełko nakrywkowe.
3. Preparat w tym, w czym się chce (Woda, Kongo, Melzer)
4. Oglądamy, czy prepatat jest zrobiony dobrze
5. Wysuszamy brzegi szkiełka przykrywkowego
6. Malujemy brzegi szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci

Czy to +/- tak się robi? Ja jeszcze nie próbowałem, tylko sobie tak wymyśliłem. Właściwie to jest konieczne coś takiego robić. W moim przypadku - iezbędne. Ledwie mam 10 min. na mikroskopowanie to zaraz
- żona coś chce
- dziecko płacze
- ble ble ble
- klient dzwoni
- dziesiątki innych spraw
i kicha - nie można 15 min. bez oderwania się od mikroskopu posiedzieć.

A że warto uważać, żeby nie zaniedbywać rodziny i obowiązków, to warto, żeby ten preparat się nie zniszczył.

No a teraz poczekam na wakacyjne towarzystwo, Marek, Darek, Ania, Vito i inni mikroskopowicze - jak Wy to robicie i czy to co wymyśliłem ma sens (widzicie - ie miałem czasu nawet sprawdzić :) ) ??

Kupiłem sobie płyn Lugola na glicerynie - nie na wodzie - "efekt uboczny" jest taki, że preparaty nie wysychają. Jeden leży w szufladzie już chyba ponad tydzień i nic mu nie jest (tj. nie wysechł).
Nie wiem co jeszcze powoduje gliceryna w preparacie, ale raczej nie utrudnia obserwacji.

Mam w mikroskopie diody LED - nie nagrzewają się tak jak żarówka, są prawie zimne.

Lugol na glicerynie jest rozwiazaniem.

Czysta gliceryna jest bardzo higroskopijna (chłonie wodę z otoczenia) i szkiełko może po pewnym czasie po prostu spłynąć. Dlatego należy ją stosować jedynie jako dodatek do wody czy innych roztworów. Spowalnia schnięcie preparatu.

Sam mam ten problem co i Pimpek, że wysycha zbyt szybko.

Mam pewne doświadczenia (ale niezadawalające) jeśli chodzi o "trwałe" preparaty i o wiele większe rozpoznanie tematu -
tu jest zbiór artykułów
http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html
wybrać "Article library"
dalej "Techniques - microtechnique"
dalej wyszukać "Safe microscopic techniques for amateurs"

Najbardziej obiecująco wygląda opcja z PVA (alkohol poliwinylowy) ale POCh sprowadza mi to już pół roku, bo w Polsce nie produkują.
Opcja z "glutowatym klejem biurowym" którą testowałem sprawia problem z racji dużej lepkości i grubości preparatu jaki wychodzi - może to się sprawdza przy grubych preparatach z częściami owadów, może trzeba poeksperymentować z innymi rozcieńczeniami, ale mi jakoś nie widzi się.

Mam też pewne pomysły na przyszłość ale o tym później, jak przezwyciężę "obiektywne problemy".

To co naraziewzględnie działa na krótszą lub dłuższą metę - po zrobieniu preparatu w dowolnym rozwtorze "uszczelniam go" rozporowadzając kroplę gliceryny wzdłuż brzegów szkiełka nakrywkowego.
To wystarcza przynajmniej na godziny.

Próbowałem też potem, po osuszeniu przez przyłożenie bibułki, pomalować boki lakierem (używałem takiego do samochód, w małych buteleczkach, do tuszowania drobnych ubytków.

Tyle, że jakoś schnie to wolno (dni) i szkiełko przy silniejszym nacisku może spłynąć. Mam też obawy co do interakcji z olejkiem imersyjnym - czy się nie rozpuszcza i nie zapapra obiektywu.

(wiadomość edytowana przez Marek 13.Sierpnia.2005)

Tak, po drodze z internet cafe, przyszedł mi do głowy świetny pomysł na rozwiązanie problemów (mało czasu, dziecko płacze, preparat wysycha) i nie jest to do końca żart.

Może nająć technika-laboranta do robienia preparatów. Myślę, że w Twojej okolicy za kilkaset zł miesięcznie można zatrudnić jakiegoś rencistę/rencistkę bez trzęsących się rąk⁽¹⁾ i z doświadczeniem, na pół etatu, do robienia preparatów, nawet półtrwałych i do mikrofotek.
Nawet mógłbym współfinansować - bo sam mam dużo do przejrzenia a czasu małowato :)

----
1) dr Mułenko, opowiadał o swojej pracy w Korei Płd. gdzie mistrzem robiącym perfekcyjne preparaty był skończony alkoholik, ręce mu się nie trzęsły tylko przy cięciu i kładzeniu szkiełka nakrywkowego; zresztą podobna ludowa opinia panuje o chirurgach :)

Jeszcze słówko o "półtrwałych preparatach" o których piszę dwie wypowiedzi wyżej.

Dzisiaj sprawdziłem preparaty wykonane pół roku temu - wg. formuły PVA-L (opcja z klejem glutowatym) ze strony:
http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artapr03/wdpart3b.html

Medium chyba podsechło bo szkiełka trzymają się lepiej (trzeba większej siły aby przesunąć), no i co najważniejsze nie wyschły.

Preparaty są z zarodnikami grzybów i zarodniki nadal wyglądają równie dobrze jak wcześniej.
Zarodniki Russula przed zalaniem tym medium były traktowane wcześniej Lugolem i są wybarwione nieżle (choć może słabiej niż w samym Lugolu.

Jak pisałem problemem była duża lepkość tego medium.

Dzisiaj zrobiłem kilka preparatów z zarodnikami dodając do medium równą ilość wody destylowanej - lepkość jest istotnie mniejsza ale co z tym dalej będzie to zobacze za jakiś czas.
Wykonam też próby z preparatami tkanek - tu mogą być większe problemy z pęcherzykami powietrza z racji większej gęstości medium. O wynikach dam znać.

Kluczową sprawą, zresztą jak przy dowolnym medium, jest aby dać go jak najmniej, "ćwierć kropelki albo i mniej", tyle i nie więcej ile minimalnie jest potrzebne aby wypełnić przestrzeń pod szkiełkiem nakrywkowym. Wtedy raz, ze szkiełko nie pływa, dwa preparat jest cieńszy.
Jak jest zbyt dużo medium można zawsze je zebrać przykładając chusteczkę higieniczną, ale to nie jest optymalne wyjście i rodzi pewne problemy.

Docelowo warto jeszcze rozważyć opcję wg. przepisu PVA-G z wyżej wymienionego artykułu.
Z kwasem mlekowym jest ten problem, że może "przeświecać" ściany komórkowe - czyli stopniowo je rozkładać - czynniąc z czasem niewidocznymi drobne struktury.

Jeszcze o lepkości - doczytałem się we wzmiankowanym artykule o lepkości (ale jako PVA do sporządzenia medium - więc nie jest jasne jak to ma być "na wyjściu") powinna wynosić 24-32 centiPoise.
To w każdym bądź razie daje jakąś wskazówkę jak bardzo rozcieńczyć wodą PVA.
Dla wyczucia:
- lepkość oleju roślinnego mieści się w granicach 16-100 centiPoise,
woda - 1
krew - 10
gliceryna - 16
oleje silnikowe zwykle ponad 100 do kilkuset
miód 3000.

Tak więc ma to być dość rzadkie.

więc moje doświadczenia z trwałymi preparatami z mediami na bazie alkoholu polywinylowego (PVA) są raczej nie zachęcające - trudno uzyskać cienki preparat (medium ma dość dużą lepkość), może nadaje się to do grubych rzeczy, typu owady, do mykologii nie bardzo
wadą jest też łatwe tworzenie pęcherzyków powietrza i trudność z ich usunięciem

natomiast mam pozytywne doświadzenia z laktofenolem - patrz:
https://www.bio-forum.pl/messages/33/16226.html#POST24312

Witam.
Dla zainteresowanych alkoholem poliwinylowym PVA w formie skrystalizowanej ( podobny do krzyształu cukru) oraz jego ilosci prosze pisać na chilliout@interia.pl
Pozdrawiam

Rewelacyjnym medium, w ktorym mozna utrwalac preparaty na nawet 100 lat jest medium Hoyer'a.
Skladniki:
15 g gumy arabskiej, 100 g wodzianu chloralu, 10 g gliceryny, 25 ml wody destylowanej.
Przepis: rozpuscic gume w wodzie (przez 24 godziny) dodajac krysztalek wodzianu chloralu wielkosci groszku (w celu zachamowania wzrostu bakterii), dodac reszte wodzianu chloralu i zostawic roztwor na kilka dni az wszystko sie dobrze rozpusci, dodac gliceryne.
Medium jest rewelacyjne do wykonywania trwalych preparatow ze sluzowcow. Probowalam tez utrwalac w tym "tkanki" grzybow, ale problem jest z obiektami bezbarwnymi, poniewaz wodzian chloralu ma wlasciwosci rozswietlajace, wiec bezbarwne obiekty praktycznie znikaja i w swietlnym mikroskopie ich nie widac (mozna natomiast ogladac w mikroskopie z kontrastem fazowym)
W celu ogladania bezbarwnych obiektow mozna zredukowac wodzian chloralu do 2% albo zastapic go 0,1% fenolem.
Mam tez przepis na medium Hoyer'a z fuksyna zasadowa, ktory moze byc rowniez uzywany do barwienia i utrwalania rownoczesnie:
Woda - 35 ml
wodzian chloralu - 20 g
Guma arabska - 20 g
Gliceryna - 20 g
Syrop glukozowy - 3 ml
Fuksyna zasadowa - 10 kropli lub wiecej (0,3 g na 10 ml 95% etanolu).

Ja uzywam tylko medium zrobione wedlug pierwszego przepisu (bez modyfikacji) i rzeczywiscie bezbarwne obiekty w zwyklym mikroskopie oglada sie zle. Barwienie wczesniej w czerwieni Kongo a nastepnie zatapianie w medium nie sprawdza sie, czerwien krystalizuje. Nieco pomaga (ale bardzo nieznacznie) wczesniejsze barwienie w odczynniku Melzera.
Zmodyfikowanego przepisu z dodatkiem fenolu ani z dodatkiem fuksyny jeszcze nie uzywalam, ale zamierzam wyprobowac.

Przepis na medium Hoyera, ktory podalam, dostepny jest w internecie, ale nie moge teraz wejsc na te strone, zeby Wam podac adres.
Natomiast podobny przepis na medium (nieznaczne roznice w proporcjach)i modyfikacje z fenolem i fuksyna znajdziecie w pracy:
Cunningham J. L. 1972. A miracle mounting fluid for permanent whole-mounts of microfungi. Mycologia 64(5): 906-911

Minęło ponad pół roku od problemu postawionego przez Piotrka na początku tego wątku:

"Jak zrobić preparat, do którego będę mógł wrócić za kilka mcy?"

Dodatkowo mam też proste rozwiązanie jak mieć preparat, nawet wodny, którym można spokojnie cieszyć się przynajmniej kilka dni zupełnie bez troski o wysychanie i uzupełnianie medium.

Wszystko, to w amatorskiej praktyce - czyli szybko, tanio i bez niedostepnych dla amatora akcesoriów.

c.d.n

Na początek podsumowanie wcześniejszych moich doniesień i doświadczeń.

Laktofenol
-------

L1. Preparaty robione w laktofenolu z błękitem bawełnianym (błekit metylowy) wg. receptury podadnej na http://www.grzyby.pl/slownik-odczynniki.htm#mikroskopowanie
nie wysychają przynajmniej kilka tygodni/ miesięcy; nawet gdy brzegi szkiełka nakrywkowego nie są uszczelnione.
L2. Skrawki z żywych grzybów można umieszczać bezpośrednio w tym medium

Uwagi.
L3. Skrawki z eksykatów trzeba uprzednio nawodnić, bo suche w tym medium się nie nawodnią wystarczająco.
L4. Skrawek "nawadniany" w KOH należy przepłukać wodą. Zasada reaguje z kwasem mlekowym. Poza tym powoduje natychmiastowy zanik wybarwienia błękitem metylowym.
L5. Medium to rozpuszcza inkrustacje z węglanu wapnia (reakcja z kwasem mlekowym). Przy reakcji wydzielają się pecherzyki CO2, co jest dość kłopotliwe pod szkiełkiem nakrywkowym.

Tym niemniej, w olbrzymiej iliości przypadków jest to świetne para-trwałe medium. Pięknie i dość równomiernie (w przeciwieństwie do wybitnie nierównomiernego wychwytywania CRB) i nienazbyt intensywnie wybarwia ściany komórkowe. Dobre do obserwacji w jasnym polu, czyli tym czym wyłącznie dysponuje 98% amatorów.

Z uwagi na pewien udział wody, w tym zwłaszcza wody ze skrawków, może z czasem podsychać, pęcherze powietrza podchodzą pod szkiełko co moze utrudniać obserwację po miesiącach.

Na podsychanie jest proste rozwiązanie, które przedstawię dalej przy omawianiu dość trwałych preparatów na bazie mediów wodnych.


Medium na bazie alkoholu polywinolowego
------------
Podsumowanie dałem wyżej. Poza niewygodami preparatyki nie mogę narzekać na trwałość takich preparatów.

c.d.n.

To cudowne rozwiązanie to VALAP !


fot. 3-3548 pojemniczek z Valapem, szkiełka kitowane Valapem, aplikator

Jest to substancja, którą uszczelnia się brzegi szkiełka przykrywkowego. Tak, że woda z medium nie paruje i można się bawić preparatem przez kilka dni, albo i znacznie dłużej.

Na informacje o Valapie trafiłem poszukując informacji o czymś szybszym, praktyczniejszym i bezpieczniejszym przy stosowaniu imersji, niż lakier.
Valap jest rekomendowany w licznych procedurach badawczych, w biologii, przy obserwacji żywych komórek w wodnych mediach.


fot. 3-3552 brzegi preparatu uszczelnione lakierem samochodowym

Kłopotliwość ze stosowaniem lakieru (do paznokci, lepiej samochodowego) polega wrażliwości na zabrudzenia medium na styku szkiełka przykrywkowego i przedmiotowego, zwłaszcza "wystająca" woda jest przeszkodą.

Czyszczenie jest trudne i pracochłonne (można ten narzut zaakceptowania gdy chodzi o preparat naprawdę trwały, ale gdy taki na kilka tygodni to już nie).
Lakier (samochodowy) schnie na szkle dni, tygodnie.
Trudno nałożyć cienką i wąską warstwę. Oczywiście to kwestia narzędzi i biegłości do wytrenowania.
Lakier w pewnym stopniu się rozpuszcza w olejku imersyjnym, przy przecieraniu szkiełka etanolem - obawa o zabrudzenie soczewki czołowej obiektywu imersyjnego - przy obserwacji na skraju szkiełka, a czasem tak trzeba.

Valapem kituje się szkiełko minutkę.
Czepia się dość dobrze wszelkich brudów.
Woda w medium, o ile nie wystaje spod szkiełka nakrywkowego to mu nie przeszkadza.
Ewentualne zabrudzenia dają się łatwiej wyczyścić niż te od lakieru (tego narazie nie sprawdzałem, do z internetu).

dalej o tym skąd wziąść Valap i technice kitowania

Valap to mieszanina równych wagowo części: wazelina, lanolina, parafina

Przy parafinie uwaga - powinna to być parafina o temperaturze topnienia 50-60C.

Zamawiałem w aptece - jako lek do zrobienia. Niestety w aptece pod pojęciem parafiny rozumieją tzw. ojej parafinowy, czyli frakcję parafiny ciekłą w temperaturze pokojowej. Taki Valap ma konsystencję miękkiej maści. Też daje się stosować do uszczelniania ale to nie to.

Niewykluczone że w aptekach mają też właściwą parafinę. Ja poradziłem sobie tak że zamówiłem mieszankę wazeliny i lanoliny a odpowiednią parafinę miałem skądinąd.
Po podgrzaniu wszystko się miesza.
Po wystygnięciu substacja ma konsystencję +-podobną do konsystencji świecy.

Ponieważ w normalnej temparaturze jest to substacja miękka, ale stała. do nakładania na szkiełko musi być podgrzana. Super czystość brzegu szkiełka nie jest konieczna (choć czystsze kitowanie jest pewniejsze). Przeszkodą jest jedynie nadmiar cieczy pod szkiełkem, tak, wypływa poza szkiełko przykrywkowe. Trzeba go zebrać podsiąkiem na brzeg husteczki lub poczekać aż podeschnie woda.

Są różne sposoby zapewnienia takiej temperatury aby Valap był ciekły, aplikowalny - np. podgrzewany stolik, ale to znowu raczej nie na praktykę amatorską, pomijając że zajmuje miejsce.

Polecam prosty do zrobienia aplikator.


fot. 3-3551 szkiełko uszczelnione Valapem, końcówka apliaktora

"Lutownica" zrobiona z kilkunastocentymetrowego odcinka drutu oporowego (kewlarowego, takiego jak w żelazkach, czy piecykach). drut umieszczony pomiędzy 3 patyczkami do lodów (jeden po jednej stronie środkowego wkładu, drugi po drugiej, obłożone to zewnętrznymi patyczkami i obwinięte taśmą - także dla izolacji termicznej przy trzymaniu. Wystająca końcówka uformowana w pętelkę tak aby było wygodnie przytykać do brzegu szkiełka nakrywkowego.

Zasilane to z zasilacza 6V, z tego samego z którego zasilam lampę w mikroskopie stereokopowym.

Prawidłowe napięcie (temperatura od tego zależy) to w przypadku kilunastocentymetrowego drutu oporowego, kilka woltów.

Lutownica rozgrzewa się w ciągu kilkunastu sekund. Przytyka się pętelkę do Valapu, po czym przenosi kroplę rotopionego kitu i rozprowadza wzdłuż brzegu szkiełka.

Wygodnie to robić przy małym powiększeniu pod mikroskopem stereoskopowym. Ale i bez pomocy powiekszenia jest to trywialne.

No i potem można bawić się prepratem godziny, dni lub dłużej, bez stresu że wysycha.

Jeśli są jakieś nieszczelności to prosto jest sprawę poprawić przejeżdzająć wyżej pokazaną lutownicą po wątpliwych miejscach.
Kit jest stosunkowo miękki i łatwo go w razie potrzey usunąć końcem igły preparacyjnej.

Parafina stała jest dostępna tylko w niektórych aptekach w postaci granulek do produkcji czopków;))) i lekór recepturowych. Jest dostepna w aptekach trudniących się wykonywaniem leków recepturowych. Pafafina farmaceutyczna (stała)- nie olej parafinowy, ma temperaturę topnienia wyższą nić 60 st C. Chyba około 80 lub 90 st. C. Stosowana jest też zamiennie z parafiną histologiczną do krojenia cienkich skrawków histologicznych. Parafina histologiczna jest do kupienia w POCH i tam można sobie wybrać temperaturę topnienia od 54-58 lub 60 st. C.

Ja do wykonywania stałych preparatów histologicznych używam DPX- Ftalan dwubutylowy, ksylen i coś jeszcze. Jest to żywica syntetyczna która z powodzeniem zastępuje balsam kanadyjski. Wadą jest to że po to aby zamknąć preparat w DPX musi on być bezwzględnie odwodniony i przepojony ksylenem. Podobnie wygląda procedura zatapiania w balsamie kanadyjskim. Jakby ktoś był zainteresowany DPX to proszę o wiadomość.

Odnośnie tego co Pan Marek mówił o alkoholu poliwinylowym i ogólnie o odczynnikach to polecam tą firmę wysyłkową: http://www.chemik.aip.pl/
Ja tam kupuję wszystko co mi potrzebne już od 3 lat i się super sprawdzają dostawa w tydzień czasu od zamówienia(kurierem/pocztą polską), duży asortymęt, a co najważniejsze nie wymagają żadnych zezwoleń np. na alkohol metylowy który się bardzo w mikroskopowaniu tkanek zwierzęcych przydaje:-)
naprawdę polecam

Uwaga pierwsza: ja na razie nie mam aż takich problemów - kranówa z gliceryną w stosunku 1 : 1, mniej więcej. Zdrapać z rośliny żywicielskiej trochę tego co jest grzybem, wrzucić pod mikroskop aby zobaczyć, czy jest tam to o co chodziło pomiędzy różnorodnymi farfoclami i gotowe. Przykładowo, ostatnio tak tropię Ampelomyces quisqualis Ces. w grzybni mączniaków różnych gatunków. Trwa to krócej niż minuta na jedno oznaczenie.
Uwaga druga co do barwienia bezbarwnych zarodników i tym podobnych obiektów. Wystarczy floksyna (czerwony barwnik) z wodorotlenkiem sodu w słabym roztworze. Niestety, nie wiem gdzie mozna kupić farbkę. Swoją porcję "pozyskałem" w pracowni anatomii roślin Uniwersytetu Śląskiego przed 1980 rokiem i jeszcze sporo mi zostało do dziś.

Technikalia wykonywania preparatów mikroskopowych trwałych (na przykładzie krwi)- FILM

"Krew pod mikroskopem.
Data premiery: 10 lis 2020
Jarek Musialik
W filmie pokazano w jaki sposób samodzielnie wykonać preparat mikroskopowy trwały z własnej krwi."

https://www.youtube.com/watch?v=ZVtMt2_52m8&feature=youtu.be&fbclid=IwAR0h7C_ErmPlSq2HtEycDLiW2XTW-fZzQbXpk3HJPD7Qn3UVBtdIUkhpQ80